Aplicación del método bioquímico-colorimétrico para identificar agentes trypanocidas / Application of the biochemical-colorimetric method to identify trypanocidal agents

La tripanosomiasis americana es una enfermedad infecciosa desatendida, causada por el parásito protozoo Trypanosoma cruzi, que no cuenta con tratamiento en la fase crónica de esta enfermedad mortal, uno de los desafíos es encontrar terapias efectivas para esta compleja enfermedad, dado que no presenta síntomas asociables a la parasitosis por lo que es desconocida entre los médicos tradicionales. Nuestra Facultad está evaluando la medicina tradicional tacana como fuente de agentes antiparasitarios potenciales. El objetivo de este trabajo fue identificar productos naturales trypanocidas utilizando el método colorimétrico XTT-PMS. Para ello, se realizaron curvas de crecimiento de epimastigotes de T. cruzi y determinamos el tiempo óptimo de realización de los ensayos. Se seleccionó la población inicial de trabajo (3x106 parásitos/mL), las condiciones de incubación (medio LIT, 27ºC, 72 horas) y revelado (XTT-PMS, 4 horas). Con el protocolo optimizado, se realizaron evaluaciones de actividad de drogas control, controles naturales y 20 extractos crudos de plantas medicinales de la amazonía. La actividad se basó en cálculos de concentración inhibitoria media y se consideraron activos las sustancias con CI50<50µg/mL. De los 20 extractos evaluados, el 40% fueron activos. Las plantas más interesantes fueron Sipu sipu (CI50=8.9±1.7µg/mL), Ejije bid'u (CI50=9.1±1.5µg/mL) e Id'ene eidhue (CI50=10.8±1.1µg/mL) con valores de CI50 cercanos a los controles, confirmando la utilidad y potencial del protocolo desarrollado

American trypanosomiasis is listed among the unattended infectious disease, is caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, and has no treatment in the chronic phase of this deadly disease. One of the challenges is finding effective therapies for this complex disease, given that it does not present any associated symptoms to the parasitism and is unknown among traditional doctors. Our Faculty is evaluating tacana traditional medicine as a source of potential antiparasitic agents. The objective of this work was to identify trypanocidal natural products using the XTTPMS colorimetric method. For this, growth curves of T. cruzi epimastigotes were made to determine the optimal time to carry out the tests. The initial work population (3x106 parasites/mL), the incubation conditions (medium LIT, 27ºC, 72 hours) and revealed process (XTT-PMS, 4 hours) were selected. With the optimized protocol, activity evaluations of control drugs, natural controls and 20 crude extracts of medicinal plants of the Amazon were carried out. The activity was based on calculations of mean inhibitory concentration and substances with IC50 <50µg/mL were considered active. Of the 20 extracts evaluated, 40% were active. The most interesting plants were Sipu sipu (IC50=8.9±1.7µg/mL), Ejije bid'u (IC50=9.1±1.5µg/mL) and Id'ene eidhue (IC50=10.8±1.1µg/mL) with values of IC50 close to the controls, confirming the usefulness and potential of the developed protocol.

Método fluorométrico para identificar agentes naturales citotóxicos y su aplicación en la evaluación de agentes antiparasitarios selectivos / Fluorometric method for the identification of cytotoxic natural agents and its application in the evaluation of selective antiparasitic agents

El ministerio de salud tiene como una de las prioridades en investigación a las enfermedades infecciosas, entre las que incluye a las leishmaniasis y la tripanosomiasis americana. En la Facultad Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas se estudian especies vegetales medicinales utilizadas por la cultura Tacana como fuente de agentes antiparasitarios potenciales. Los laboratorios dedicados al descubrimiento de moléculas naturales con actividad antiparasitaria, tienen el desafío de desarrollar protocolos que permitan detectar biomoléculas selectivas, efectivas y menos tóxicas que las disponibles. Por ende, las evaluaciones antiparasitarias in vitro (CI50), deberían ir acompañadas de evaluaciones de citotoxicidad (DL50), con el fin de calcular un Índice de Selectividad (IS=DL50 / CI50) como parámetro de especificidad biológica. La citotoxicidad fue medida sobre líneas de macrófagos (RAW 264.7, murino), células involucradas en las infecciones por parásitos intracelulares. El protocolo fluorométrico parte con una población de 5x104 células/mL, incubada a 37ºC en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's médium), por 96 horas, con adición de resazurina (2mM) 3 horas antes de las lecturas finales. Bajo estas condiciones se evaluó la citotoxicidad de drogas control y 15 extractos vegetales seleccionados por su actividad anti-kinetoplastida. El extracto de Cosmailu fue el más citotóxico, Ejije bid'u resultó selectivo para T. cruzi y Leishmania amazonensis, mientras que Id'ene eidhue, fue selectivo para L. amazonensis. Finalmente, los otros 12 extractos resultaron ser poco selectivos o citotóxicos.

The Ministry of Health has infectious diseases as one of the research priorities, including leishmaniasis and American trypanosomiasis. The Faculty of Pharmaceutical and Biochemical Sciences develops evaluations of medicinal plant species used by the Tacana culture as a source of potential antiparasitic agents. Laboratories dedicated to the discovery of natural molecules with antiparasitic activity, have the challenge of developing protocols that allow the detection of selective, effective and less toxic biomolecules than those available. Therefore, in vitro antiparasitic evaluations (IC50) should be accompanied by cytotoxicity evaluations (LD50), in order to calculate a Selectivity Index (IS = LD50/ IC50) as a parameter of biological specificity. The cytotoxicity was measured on macrophage line (RAW 264.7, murine), cells engaged on intracellular parasites infections. The fluorometric protocol starts with an initial population of 5x104 cells/mL, incubated at 37ºC, in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) for 96 hours with addition of resazurin (2mM) 3 hours, before final readings. Under these conditions the cytotoxicity of control drugs and 15 plant extracts, selected by their anti-kinetoplastid activity, was evaluated. Cosumailu extract was the most cytotoxic, Ejije bid'u was selective for T. cruzi, and Leishmania amazonensis, while Id'ene eidhue, was selective for L. amazonensis. Finally, the other 12 extracts were little selective or cytotoxic.